细菌内毒素检查法是利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。检测方法一般有凝胶法和光度测定法。

1.细菌内毒素检测凝胶法原理：

利用鲎血液中的变性细胞， 经裂解液和机械方式促使细胞破裂而提取到的一种细胞溶解物， 能与极微量的细菌内毒素形成特异凝胶反应， 反应的速度和凝胶的坚固程度与内毒素浓度有关。

2. 细菌内毒素凝胶法检测所需主要设备

（1）电热干燥箱。

（2）旋涡混合器。

（3）超净工作台。

（4）试管恒温仪、恒温水浴箱或恒温培养箱。

（5）鲎试剂。是从鲎的血液中提取出的冻干试剂，可以与细菌内毒素发生凝集反应。

（6）细菌内毒素工作标准品。

（7）细菌内毒素检查用水应符合《中国药典》规定的灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.015EU/mL（用于凝胶法）或0.005 EU/mL（用于光度测定法），且对内毒素试验无干扰作用。

（8）实验所用器皿：需经处理，去除可能存在的外源性内毒素。耐热器皿常用干热灭菌法（250℃，至少30分钟）去除，若使用塑料器具，如加样吸头等应置30%双氧水中浸泡4h，再用细菌内毒素检查用水充分冲洗后置60℃烘干备用。也可以选择标明无热原的商业产品。

（9）试验常用材料器具：剪刀、砂轮、废品缸（收集碎玻璃）、无热原试管（10 mm×75 mm）、匹配的试管架、封口膜、酒精棉球、时钟、移液器及无热原吸头。

3. 鲎试剂灵敏度复核试验

当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。

目的为考察鲎试剂的灵敏度是否准确，同时也考查检验人员操作方法是否正确及试验条件是否符合规定。

4.供试品干扰试验

干扰实验的目 的是确定供试品在多大的稀释倍数或浓度下对内毒素和鲎试剂的反应不存在干扰作用， 为能否使用细菌内毒素检查法提供依据。并且验证当供试品的配方和工艺有变化， 鲎试剂来源改变或供试品阳性对照结果呈阴性时供试品是否存在干扰作用。由于干扰实验检验的是在供试品存在的情况下内毒素与鲎试剂的反应是否正常， 与所使用鲎试剂的灵敏度无关， 因此在干扰实验预实验中原则上可使用任一灵敏度的鲎试剂。但建议使用较低灵敏度(如 0.5 或 0.25EU／ m1)的鲎试剂， 可尽量避免供试品所含的内毒素对干扰实验造成的阳性影响。

（1）对未知或可疑的供试品初次进行细菌内毒素试验之前应先进行干扰试验，目的是检验供试品对细菌内毒素试验是否有抑制或增强作用，以及其他影响细菌内毒素试验准确性和敏感性的干扰作用。

（2）当鲎试剂、供试品来源、供试品配方或生产工艺有变化或其他任何可能影响细菌内毒素试验结果的试验条件改变时，应重新进行干扰试验。

（3）每种产品应取3批，并分别使用不少于两个制造商生产的鲎试剂进行干扰试验。

5.试验准备

（1）确认所需试验的试剂：鲎试剂、细菌内毒素工作标准品、细菌内毒素检查用水

（2）确认所需试验的器具材料（如上）

6.试验方法

（1）同一批号选取至少3各单位供试品；

（2）供试液的制备：供试品应使用细菌内毒素检查用水为浸提介质。根据本单位产品标准规定的细菌内毒素限值确定浸提介质的体积。

7.凝胶法操作方法

（1）细菌内毒素标准溶液的制备(按说明书进行）

（2）鲎试剂灵敏度复核试验

根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟或参照标准品说明书中要求的混匀时间进行操作，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒或参照标准品说明书中要求的混匀时间进行操作。取不同浓度的内毒素标准溶液，分别与等体积（如0.1mL）的鲎试剂溶液混合，每一个内毒素浓度平行做4管；另外取2管加入等体积的细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37℃±1℃的恒温器中，保温60分钟±2分钟。

将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。保温和拿取试管过程应避免受到振动，造成假阴性结果。

当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（λc）。

λc=antilg（∑X/n）

式中　X 为反应终点浓度的对数值(lg)。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度；

n 为每个浓度的平行管数。

当λc在0.5～2λ(包括0.5λ和2λ)时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。

（3）干扰试验

a、应开展干扰试验预实验，确定供试品的最小不干扰稀释倍数；采用多个不同稀释倍数的供试品溶液，如某医疗器械产品限值为20EU/件，鲎试剂灵敏度为0.25EU/mL,按MVD=L/λ，【20EU/件÷0.25EU/mL=80】，则其最大有效稀释倍数为80mL/件。

b、在预定的稀释倍数下开展正式干扰试验

按表1制备溶液A、B、C和D，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数(MVD)的溶液，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。

只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验要求时，试验方为有效。当系列溶液B的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验要求时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。其他情况则认为供试品在该浓度下存在干扰作用。若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。

可通过对供试品进行更大倍数的稀释或通过其他适宜的方法(如过滤、中和、透析或加热处理等)排除干扰。为确保所选择的处理方法能有效地排除干扰且不会使内毒素失去活性，要使用预先添加了标准内毒素再经过处理的供试品溶液进行干扰试验。

（4）凝胶限度试验

按表2制备溶液A、B、C和D。使用稀释倍数不超过MVD并且已经排除干扰的供试品溶液来制备溶液A和B。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。

（5）结果判断

保温60分钟±2分钟后观察结果。

若阴性对照溶液D的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液B的平行管均为阳性，阳性对照溶液C的平行管均为阳性，试验有效。

若溶液A的两个平行管均为阴性，判定供试品符合规定。

若溶液A的两个平行管均为阳性，判定供试品不符合规定。

若溶液A的两个平行管中的一管为阳性，另一管为阴性，需进行复试。复试时溶液A需做4支平行管，若所有平行管均为阴性，判定供试品符合规定，否则判定供试品不符合规定。

若供试品的稀释倍数小于MVD而溶液A结果出现不符合规定时，可将供试品稀释至MVD重新实验，再对结果进行判断。

8.如供试品对细菌内毒素试验有干扰，可选用下列方法排除干扰：

（1）使用更灵敏的鲎试剂对供试液进行更大倍数稀释；

（2）采用无热原氨基甲烷缓冲液稀释供试液；

（3）采用无热原氢氧化钠或盐酸溶液调节供试液pH值在6.0~8.0范围内；

（4）采用阳离子缓冲液稀释供试液以调节离子浓度。

11.注意事项

（1）试验操作应在清洁环境中进行，过程中应防止内毒素的污染。在使用移液器取样时，应注意不要将移液器中的气体吹入溶液中。

（2）试验操作过程中人员应做好防护，避免割伤或内毒素标准品感染。

（3）开启细菌内毒素国家标准品或工作标准品、鲎试剂时，先轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，蓝点向外，75%酒精棉球擦拭后启开，启开过程中应防止玻璃碎片落入瓶内。

（4）溶解鲎试剂及混匀供试品和鲎试剂时，试验过程中应注意更换吸头，以避免检查用水的污染及溶液的交叉污染。

（5）由于凝集反应是不可逆的，所以在反应过程中及观察结果时应注意不要使试管受到振动，使凝胶破碎产生假阴性结果。

（6）进行干扰试验时，标准对照系列和含内毒素的供试品溶液系列应同时进行；如经检验证实供试品对细菌内毒素试验有不能排除的干扰作用则不适宜采用凝胶限度法。

（7）在进行鲎试剂灵敏度复核、干扰试验和供试品细菌内毒素检查时，各个试验中要求的对照应同时进行，并在试验有效的情况才能进行计算和判断。

（8）2020版《中国药典》1143细菌内毒素检查法包括凝胶法和光度测定法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。

内毒素检查法PPT